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      【答题赢好礼】寻找RNA提取最强知识青年

      发布日期:2021年06月02日   浏览次数560

      为什么RNA提取这么难?

      1. RNA为单链结构且有2’-OH存在,分子结构不稳定

      2. RNase无处不在,且稳定性高

      3. 样本本身所含RNA丰度较低,难以获得

      4. 细胞中次生代谢物干扰RNA提取


      快来和小师妹一起学习一下

      提升RNA提取质量的六要素


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      01 正确的样本保存方法及条件

      用于提取RNA的样本应尽量采用新鲜样本,并尽快在低温冻存或保存液中保存,以抑制RNase的活性。动物组织和血液可在4℃或常温条件下分别保存于RNAStore ReagentRNALock Reagent中。提取后的RNA应采用RNase-free H2O溶解后分装冻存,长期保存建议冻存于-80℃。

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      02 样本均质彻底

      彻底破碎细胞结构,能使细胞充分释放RNA,并使裂解液充分浸润,抑制核酸酶活性。样本数量较少时可采用传统的液氮研磨进行均质,当样本数量较多时,可采用TGrinder H24R 组织研磨低温均质仪一次可对24个样本进行低温均质处理。

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      03 有效的RNase活性抑制

      RNase活性的抑制效果决定了RNA提取的完整性。裂解液中的变性剂,能够使蛋白变性、抑制RNase的活性。为了达到更好的RNase抑制效果,往往会在裂解液中额外加入β-巯基乙醇。β-巯基乙醇具有较强的挥发性,为更安全的提取RNA,可采用RNA Easy Fast快速总RNA提取试剂盒。该试剂盒采用与蛋白酶K相结合的形式,有效裂解细胞、抑制RNase活性。

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      04 采用合适的样本用量

      当样本量过大时,裂解液无法充分裂解细胞、抑制RNase活性, RNA的提取效率及完整性下降,同时还会使溶液pH偏碱性,影响RNA的稳定性并造成基因组的残留。


      当提取样本量过小或本身RNA丰度偏低时,如血浆等无细胞或少细胞体液样本,需使用专用的微量RNA提取试剂盒,RNAprep Pure微量样本总RNA提取试剂盒配备Carrier RNA,能够捕获微量核酸,提高RNA的提取效率。

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      05 选择合适的RNA纯化方式

      RNA的纯化可分为有机抽提、硅基质柱和磁珠纯化等方式。硅基质柱法由于操作简便、快速以及所获得的RNA纯度高等特点,被广泛应用。此方法纯化应用灵活,能够与DNase I相结合,在提取RNA的过程中去除基因组DNA,如RNAprep Pure总RNA提取试剂盒(适合样本:细菌动物组织植物组织血液石蜡包埋组织能够在1小时内完成总RNA的提取和基因组DNA的去除。

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      06 多糖多酚的去除策略

      多糖多酚植物样本是RNA提取中的难点。多糖理化性质与RNA相似,易形成共沉淀;多酚易氧化形成醌类,与RNA形成不可逆的结合,降低后续酶促反应的效率。RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒能够有效的沉淀多糖、螯合多酚、抑制氧化酶活性,从而提高RNA的提取效率和纯度。


      只要掌握了这些要点

      就能快速提升你的RNA提取质量啦!

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